Biacore T200全功能分子相互作用分析儀是一種萬(wàn)用的、無(wú)標(biāo)記系統(tǒng)，它具有*的靈敏度和*低的噪音。用于生物分子作用的詳細(xì)分析，適用范圍從早期藥物開發(fā)研究到開發(fā)，直至質(zhì)量控制。 系統(tǒng)提供高質(zhì)量動(dòng)力學(xué)、親和性、濃度、特異性、選擇性以及熱動(dòng)力學(xué)作用數(shù)據(jù)，這些分析均實(shí)時(shí)地、高靈敏度地完成。 此系統(tǒng)可以更高的精度和自信度完成動(dòng)力學(xué)范圍末端發(fā)生的相互作用分析。

推進(jìn)無(wú)標(biāo)記作用分析的檢測(cè)限

Biacore T200 的靈敏度確保對(duì)*小有機(jī)成分的親和性分析，并且其分析功能可延伸到的動(dòng)力值測(cè)定領(lǐng)域。 這樣就可能先前獲得的邊界數(shù)據(jù)進(jìn)行可靠的解釋，從而完成對(duì)*簡(jiǎn)便分析物的動(dòng)力學(xué)分析，以及對(duì)低冗余度蛋白質(zhì)的檢測(cè)。

性能范圍

Biacore T200 支持使用 96 孔和 384 孔微孔板以及試瓶。 由于同時(shí)使用四個(gè)流動(dòng)池要，可同時(shí)對(duì)四種相互反應(yīng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 Biacore T200 的樣本倉(cāng)可冷卻至 4°C，從而可在無(wú)人看護(hù)的情況下，對(duì)敏感型樣本進(jìn)行長(zhǎng)達(dá) 48 小時(shí)的分析。

保證易用性的軟件向?qū)Ш湍０?

Biacore T200 軟件適用于具有不同經(jīng)驗(yàn)水平的用戶。 軟件向?qū)г谡麄€(gè)分析過(guò)程均可提供支持，從開發(fā)直至數(shù)據(jù)解讀，簡(jiǎn)化了整個(gè)過(guò)程并縮短了獲取結(jié)果的時(shí)間。

快速、簡(jiǎn)便的動(dòng)力學(xué)分析

Biacore T200 軟件提供了大量的工具，幫助用戶進(jìn)行自信且可靠的動(dòng)力學(xué)分析。 這些分析可采用多周期法或單周期動(dòng)力學(xué)分析法來(lái)完成。

? 一個(gè)平臺(tái)即可完成高質(zhì)量的綜合鑒定，包括動(dòng)力學(xué)、親和性、特異性、濃度以及熱動(dòng)力學(xué)的鑒定

? 增進(jìn)對(duì)分子機(jī)理以及結(jié)構(gòu)-功能關(guān)系的理解

? 定義潛在的藥靶和診斷標(biāo)記物

? 選擇和鑒定生物療法候選藥

? 藥物開發(fā)過(guò)程中選擇和優(yōu)化前導(dǎo)成分

? 免疫原性研究中檢測(cè)和鑒定耐藥性抗體

（一）T200技術(shù)參數(shù)

（二）T200性能表現(xiàn)

一、擴(kuò)展非標(biāo)記相互作用分析的檢測(cè)極限

Biacore T200專為要求高靈敏度的分子間相互作用的分析而設(shè)計(jì)：

1）小的有機(jī)化合物（無(wú)*低分子量限制）

2）低豐度分子（濃度大于10pM）

3）稀有或敏感的靶蛋白，如G蛋白偶聯(lián)受體

4）避免了分析與二價(jià)抗體之間相互作用時(shí)親和效應(yīng)的干擾

5）微弱相互作用分析，K_D在mM范圍內(nèi)

6）穩(wěn)定的結(jié)合物，k_d≥10^-5 S^-1

1、測(cè)定稀有或敏感靶蛋白

從低水平捕獲蛋白獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)有利于分析小分子和諸如G蛋白偶聯(lián)受體等敏感蛋白的相互作用，而這些蛋白往往是*重要的藥物靶蛋白。而Biacore T200的高靈敏性意味著蛋白固定后僅需小部分分子保留活性即可用于分析。此外，稀有靶蛋白使用量較少，使得消耗降低的同時(shí)并不影響數(shù)據(jù)質(zhì)量。敏感靶蛋白的研究因此更加可信，縮短了藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的檢測(cè)時(shí)間。

2、分析方法設(shè)計(jì)更加靈活

在評(píng)估抗體用作治療、分析或診斷工具的適用性時(shí)，對(duì)抗原-抗體相互作用進(jìn)行全面特征鑒定很重要。當(dāng)利用Biacore進(jìn)行抗原-抗體分析時(shí)，通常情況下建議將抗體固定于傳感器表面以免其親和作用（Avdity Effect）影響數(shù)據(jù)解讀。然而，在特定情況下，人們更傾向于固定抗原，這是出于節(jié)約珍貴靶分子的考慮或抗原分子更易于固定。Biacore T200的高靈敏度足以降低抗原捕獲水平以避免親和效應(yīng)，進(jìn)而使得分析方法的設(shè)計(jì)可以靈活多樣。

3、更廣動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)的高度性分析

Biacore T200中的微流控系統(tǒng)經(jīng)過(guò)優(yōu)化以用于高質(zhì)量的動(dòng)力學(xué)分析。四個(gè)流動(dòng)池可靈活用于單一的、配對(duì)的或者系列運(yùn)行。配對(duì)的芯片上流動(dòng)池接口使得流動(dòng)池之間的空間被降到*低水平，確保了的標(biāo)準(zhǔn)差減。

Biacore T200可以測(cè)定從*快的結(jié)合速率到*慢的解離速率的*廣范圍內(nèi)的動(dòng)力學(xué)常數(shù)。這可用于對(duì)強(qiáng)結(jié)合物進(jìn)行排序，這一點(diǎn)對(duì)于抗體篩選非常重要。此外還可以用于檢測(cè)快速結(jié)合的相互作用物之間的差別，這在收到生物利用率限制的生物學(xué)過(guò)程的研究中非常重要。

1）k_a從10³到5X10⁷M^-1s^-1（對(duì)于大分子待檢物為10³到3X10⁹ M^-1s^-1）

2）k_d從10^-5到1s^-1

二、性能范圍

1、自動(dòng)運(yùn)行條件下可分析高達(dá)384種樣品

Biacore T200支持96和384孔板和小瓶的使用。四個(gè)流動(dòng)池的使用使得四種相互作用可被同時(shí)檢測(cè)。Biacore T200的樣品槽可以降溫到4℃，使得敏感樣品可以在高達(dá)48小時(shí)無(wú)人值守的運(yùn)行中得以分析。

2、在生理溫度下研究分子間相互作用來(lái)預(yù)測(cè)體內(nèi)狀態(tài)的情況

通過(guò)提高在生理溫度下測(cè)定的可靠數(shù)據(jù)，Biacore T200確保更加準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)體內(nèi)狀態(tài)下的治療性分子的特性。系統(tǒng)一體的緩沖液除氣裝置防止在溫度升高的情況下形成氣泡，有助于確保更高質(zhì)量的數(shù)據(jù)。此外，一體的除氣裝置也可以省略運(yùn)行前對(duì)緩沖液進(jìn)行的除氣操作。

3、運(yùn)行緩沖液篩選有助于快速分析方法開發(fā)

內(nèi)置的緩沖液選擇裝置在每次運(yùn)行中可*多測(cè)試四種緩沖液，加快了分析方法的開發(fā)。例如，結(jié)合特性的微環(huán)境效應(yīng)可在機(jī)制性和穩(wěn)定性研究中進(jìn)行分析。

4、回收樣品以用于質(zhì)譜鑒定

Biacore T200結(jié)合質(zhì)譜為在功能性結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上鑒定蛋白質(zhì)提供了可能。樣品的回收及消化均具有軟件支持。

1）被分析物以很小的體積被回收，使得濃度*化。

2）從樣品到回收溶液盡可能減少殘留。

3）在含有消化溶液的瓶中沉淀。

4）軟件模板預(yù)先設(shè)置有整個(gè)回收過(guò)程。

三、快速、簡(jiǎn)單的動(dòng)力學(xué)分析

Biacore T200軟件為可信的和準(zhǔn)確的動(dòng)力學(xué)分析上提供了廣泛的工具。可使用多循環(huán)方法；或者采用單循環(huán)動(dòng)力學(xué)分析：由于不需要進(jìn)行每次注入樣品之間的表面再生過(guò)程，單循環(huán)動(dòng)力學(xué)分析使得那些涉及難以再生的靶蛋白分析能夠?qū)崿F(xiàn)，并且縮短了分析開發(fā)的時(shí)間。

Biacore T200數(shù)據(jù)評(píng)估軟件可使分子間相互作用的動(dòng)力學(xué)分析通過(guò)幾個(gè)簡(jiǎn)單的點(diǎn)擊來(lái)實(shí)現(xiàn)。

1）同時(shí)處理多重樣品以簡(jiǎn)化數(shù)據(jù)分析過(guò)程并且節(jié)省時(shí)間

2）使用一個(gè)或幾個(gè)現(xiàn)有的相互作用模型擬合動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)

3）自動(dòng)減去參照和空白對(duì)照數(shù)據(jù)

（三）經(jīng)典應(yīng)用

1、繪制凋亡信號(hào)通路

通過(guò)研究點(diǎn)突變凋亡蛋白和細(xì)胞表面受體之間的相互作用可以揭示出細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)通路。

研究表明，凋亡蛋白LIGHT可與兩種細(xì)胞受體：淋巴細(xì)胞毒素-β受體（LTβR）和皰疹病毒穿入介質(zhì)（HveA）相結(jié)合。通過(guò)在可能參與受體結(jié)合的肽環(huán)處引入點(diǎn)突變，Biacore方法可考查這些突變對(duì)LIGHT蛋白結(jié)合特性的影響。

實(shí)驗(yàn)對(duì)野生型和LIGHT突變體與其受體間的相互作用分別進(jìn)行了研究。通過(guò)抗體捕獲技術(shù)講HveA蛋白和LTβR蛋白固定于傳感芯片表面。體外分析發(fā)現(xiàn)，其中一種LIGHT突變體可以與HveA蛋白結(jié)合，卻不能與LTβR蛋白相結(jié)合，也沒(méi)能導(dǎo)致靶細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果有力的暗示，LIGHT通過(guò)與其細(xì)胞表面受體相互作用時(shí)至少激活了兩條不同的信號(hào)通路，而且只有其中一條通路會(huì)引發(fā)凋亡。

2、配體垂釣

從細(xì)胞條件培養(yǎng)基中鑒定與細(xì)胞表面受體相互作用的可能配體。

將一個(gè)含細(xì)胞表面受體Flt4胞外域的Fc融合蛋白固定在傳感芯片表面。將來(lái)自100種不同細(xì)胞系的濃縮培養(yǎng)基流經(jīng)芯片表面。當(dāng)把這些培養(yǎng)基用生物學(xué)方法檢測(cè)時(shí)，只有在Biacore實(shí)驗(yàn)中能與Flt4結(jié)合的培養(yǎng)基才能夠誘導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞中的Flt4受體發(fā)生酪氨酸磷酸化。

隨后，經(jīng)過(guò)親和層析柱的分離和SDS-PAGE電泳，三種與Flt4結(jié)合活性相關(guān)的多肽被收集。

由收集到的其中兩種肽段中部分氨基酸序列合成變性PCR引物，擴(kuò)增出一個(gè)65 bp的產(chǎn)物。測(cè)序結(jié)果顯示，該產(chǎn)物中含有一段和已知氨基酸序列完全匹配的序列。這段cDNA被用來(lái)鑒定Flt4的配體，確認(rèn)該蛋白在新轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的生物功能，同時(shí)還可以用于發(fā)現(xiàn)與其功能相關(guān)的生長(zhǎng)因子的同源區(qū)域，從而研究這些配體的基因表達(dá)狀態(tài)。

3、蛋白-蛋白相互作用

研究多組分蛋白復(fù)合體對(duì)生物過(guò)程的調(diào)節(jié)

補(bǔ)體旁路（alternative complement）蛋白C3b部分受到血漿蛋白因子H（fH）的調(diào)節(jié)。通過(guò)對(duì)fH與表面結(jié)合蛋白C3b相互作用位點(diǎn)進(jìn)行鑒定，有助于理解補(bǔ)體旁路為什么只會(huì)被異己組織激活。

將C3b連同其蛋白水解片段C3c和C3d固定于芯片表面。 將8個(gè)fH片段通過(guò)注射流經(jīng)芯片表面，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿蛋白因子H (fH) 上存在三種不同的與C3b結(jié)合的位點(diǎn)。

每個(gè)fH片段都與C3b上不同的位點(diǎn)相互作用。位點(diǎn)1僅與完整的C3b作用，位點(diǎn)2與C3b和C3c結(jié)合，而位點(diǎn)3與完整C3b和C3d片段結(jié)合。C3b和fH之間的多重交互作用對(duì)于理解補(bǔ)體旁路與異體和宿主結(jié)構(gòu)之間存在的專一反應(yīng)性提供了分子基礎(chǔ)。

4、Biacore系統(tǒng)與質(zhì)譜

Biacore系統(tǒng)與電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)（ESI-MS/MS）聯(lián)合為研究者提供一種新的分析方法，用來(lái)捕獲發(fā)生相互作用的蛋白并進(jìn)行回收與鑒定。該技術(shù)提供了一整套包含檢測(cè)、捕獲及回收中低飛摩爾量級(jí)蛋白的方法。

將三磷酸肌醇（IP3）固定在芯片表面，將轉(zhuǎn)化有IP3結(jié)合蛋白的細(xì)菌裂解物流經(jīng)芯片表面。隨后，通過(guò)空氣隔斷的方法（air partition method）將微量的胰酶送至結(jié)合蛋白處進(jìn)行消化。酶解的肽段通過(guò)反相毛細(xì)管柱富集并除去了可能干擾質(zhì)譜分析的雜質(zhì)。從反相上洗脫的肽段混合物通過(guò)液質(zhì)聯(lián)用串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)進(jìn)行分析，*終確定IP3結(jié)合蛋白的存在。

5、檢測(cè)臨床實(shí)驗(yàn)中治療抗體的免疫源性

作為治療藥物，小鼠抗體由于會(huì)激起機(jī)體免疫應(yīng)答而受到限制。紐約Ludwig腫瘤研究中心的研究人員構(gòu)建出一個(gè)人源化的小鼠單克隆抗體藥物，該藥物將CDR區(qū)域嫁接進(jìn)人IgG骨架，能識(shí)別人結(jié)腸上皮和結(jié)腸癌中特異表達(dá)的一種標(biāo)記物。這種嵌合抗體在患有結(jié)腸癌的病人身上進(jìn)行I期和II期臨床檢測(cè)，其免疫源性通過(guò)無(wú)標(biāo)記蛋白相互作用分析進(jìn)行監(jiān)控。

將人源化抗體（huAb A33）固定在傳感芯片表面，并在制備好的芯片表面注入病人的血清。反應(yīng)人群被大體劃分為兩大類。 I型反應(yīng)人群的特點(diǎn)是在2周時(shí)間內(nèi)血清中出現(xiàn)有抗huAb A33的抗體，盡管病人持續(xù)接受huAb A33治療，但抗huAb A33抗體的滴度開始不斷下降。而另一邊，II型反應(yīng)人群的免疫應(yīng)答反應(yīng)較緩慢，但隨著治療的繼續(xù)，抗體滴度持續(xù)增加。在后一組中，生理性不良反應(yīng)比I型更加頻繁，因此，*終停止了使用huAb A33對(duì)這些病人進(jìn)行治療。

此外，病人抗體響應(yīng)的亞類也可通過(guò)Biacore夾心檢測(cè)進(jìn)行鑒定。簡(jiǎn)言；所有病人樣品當(dāng)預(yù)先將蛋白G加入稀釋血清后（去除IgG）其抗huAb A33反應(yīng)幾近消失，而有一些病人采用正辛酸處理（沉淀所有的非IgG蛋白）則沒(méi)有太大的影響。極少的病人在用蛋白G處理血清后仍有殘留的活性存在，這些信號(hào)可通過(guò)向傳感芯片表面注入抗IgM抗體檢測(cè)到。

具有II型反應(yīng)的病人數(shù)周內(nèi)都沒(méi)有出現(xiàn)不良生理癥狀，直到幾周后，用Biacore檢測(cè)到抗huAb A33抗體水平持續(xù)增加。因此研究人員可以采用無(wú)標(biāo)記蛋白相互作用分析對(duì)可能出現(xiàn)的不良反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測(cè)。

（四）實(shí)際案例

1、蛋白-蛋白相互作用

配體：蛋白HSA

分析物：蛋白HE，~6KDa

ka(1/Ms)=2.434*E5    kd(1/s)=9.89*E-4    KD(M)=4.064*E-9

SE(Ka)=3.9*E+2       SE(kd)=1.3*E-6

從傳感圖得知，實(shí)驗(yàn)*監(jiān)測(cè)到信號(hào)，信號(hào)明顯且呈現(xiàn)良好的濃度依賴性。

數(shù)據(jù)QC模塊顯示數(shù)據(jù)分析結(jié)果合理科學(xué)，結(jié)果真實(shí)可信。