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目前引物合成基本采用固相亞磷酰胺三酯法。DNA合成儀有很多種, 主要都是由ABI/PE 公司生產(chǎn),無論采用什么機器合成,合成的原理都相同,主要差別在于合成產(chǎn)率的高低,試劑消耗量的不同和單個循環(huán)用時的。申能*公司采用的合成儀主要機型為ABI3900高通量合成儀,合成長鏈主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成儀,引物修飾和高OD數(shù)合成采用ABI394等。
亞磷酰胺三酯法合成DNA片段,具有高效、快速的偶聯(lián)以及起始反應物比較穩(wěn)定的特點。亞磷酰胺三酯法是將DNA固定在固相載體上完成DNA鏈的合成的,合成的方向是由待合成引物的3'端向5'端合成的,相鄰的核苷酸通過3'→5'磷酸二酯鍵連接。
*步是將預先連接在固相載體CPG上的活性基團被保護的核苷酸與三氯yi酸反應,脫去其5'-羥基的保護基團DMT,獲得游離的5'-羥基;
第二步,合成DNA的原料,亞磷酰胺保護核苷酸單體,與活化劑四氮唑混合,得到核苷ya磷酸活化中間體,它的3'端被活化,5'-羥基仍然被DMT保護,與溶液中游離的5'-羥基發(fā)生縮合反應。
第三步,帶帽(capping)反應,縮合反應中可能有極少數(shù)5'-羥基沒有參加反應(少于2%),用yi 酸酐和1-甲基咪唑終止其后繼續(xù)發(fā)生反應,這種短片段可以在純化時分離掉。
第四步,在氧化劑碘的作用下,亞磷酰形式轉(zhuǎn)變?yōu)楦€(wěn)定的磷酸三酯。
經(jīng)過以上四個步驟,一個脫氧核苷酸被連接到固相載體的核苷酸上。再以三氯yi酸脫去它的5'-羥基上的保護基團DMT,重復以上步驟,直到所有要求合成的堿基被接上去。合成過程中可以觀察TCA處理階段的顏色判定合成效率。
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